سمرقند کا محاصرہ دونوں جنگجوؤں کی طرف سے شہر کے خلاف تیسری اور آخری مہم تھی۔ بابر کی افواج کے ہاتھوں اس کے دوبارہ قبضے کے چار سال بعد، ایک بغاوت ہوئی جس نے فرغانہ کے بادشاہ کو اس کی سلطنت اور اس کی راجدھانی کھو دی۔ 1501 میں، بابر اور اس کی فوج نے دوبارہ شہر کا محاصرہ کرنے کے لیے تیار محسوس کیا۔ تاہم، اس کی حملے کی کوشش کو ایک ازبک قبائلی سردار شیبانی نے شکست دی جس کی فتوحات پورے وسطی ایشیا میں مشہور تھیں۔ اس سے پہلے مئی 1497 میں بابر اور سلطان علی کی دو فوجوں نے کامیابی سے سمرقند شہر کا محاصرہ کیا اور اس پر قبضہ کر لیا۔
